禾谷孢囊线虫新效应因子Ha-G20E03基因克隆及用于研究其功能的新模式系统的探索.docx

密级论文编号中国农业科学院禾谷孢囊线虫新效应因子HaG20E03基因克 隆及用于研究其功能的新模式系统的探索Cloning of a new effector gene Ha-G20E03 in cereal cyst nematode and exploration of a potential new pathosystem to investigate its interations with cereal hosts硕士研究生吴独清指导教师彭德良研究员 申请学位类别农学硕士业植物病理学 方向分子植物病理学专研培究养单位植物保护研究所研究生院2015年6月万方数据SecrecyNoChinese Academy of Agricultural Sciences DissertationCloning of a new effector gene Ha-G20E03 in cereal cyst nematode and exploration of a potential new path osystem to investigate its interations with cereal hostsMSCandidateDuqing-Wu SupervisorDeliang--Peng Professor MajorPlant Pathology SpecialtyMolecular Plant PathologyJune 2015万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名景弛漓时间2015年6月3同关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即中国农 业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用 不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名关独甬时间2015年6月3日翩虢气从帆201 5年6 fl 3网万方数据中国农业科学院 硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表禾谷孢囊线虫新效应因子HaG20E03基因克隆论文题目及用于研究其功能的新模式系统的建立分子植物病理论文作者吴独清专业植物病理学研究方向1指导教师彭德良研究员培养单位研究所植物保护研究所硕姓名职称博单位专业签名评硕导口博导口阅硕导口人博导口口枷芝公辩硕导口中国农业科学院主谢丙炎研究员博导囱蔬菜花卉研究所植物病理学席简恒教授硕导口中国农业大学农学与植物病理学绷i研究员硕导回河北省农林科学院植植物病理学糊博导耐生物技术学院陈二龙博导口物保护研究所败夏桂先研究员硕导口中国科学院微生物研生物化学与瓢艺博导耐究所分子生物学V、辩，硕导面r国农业大学农学与吴学宏副教授博导口生物技术学院植物病理学彳饧多委t简桂良研究员硕导函中国农业科学院植物植物病理学旆沈、博导口保护研究所贝1黄文坤副研究员硕导留中国农业科学院植物植物病理学 凑美蜘支一博导口保护研究所会议记录秘书彭焕2015年5月27日一F午330500 论文答辩时间地点中国农业科学院植物保护研究所第一会议室万方数据摘要禾谷孢囊线虫是世界上广泛分布的一种重要植物病原，给小麦粮食生产安全造成了严重威胁。 植物线虫通过其V1针向寄主植物细胞分泌效应子蛋白，从而促进线虫寄生和引起植物致病。但是 迄今为止，有关于禾谷孢囊线虫效应子分子机制研究还十分肤浅，这主要是因为其研究缺乏一个 合适的病害系统。本实验首先基于转录组文库数据，利用RACE法克隆一个推定效应子基因cDNA全长。该基 因全长837bp，其中包含一个585bp的开放阅读框，编码194个氨基酸，在N端拥有一个21个氨基酸的信号肽，且不含跨膜结构域。通过BLAST比对发现，该基因与大豆孢囊线虫G20E03拥有90的同源性，因此我们将其命名为HaG20E03基因。通过原位杂交实验，HaG20E03基 因在禾谷孢囊线虫食道腺细胞中特异性表达，可能在禾谷孢囊线虫寄生过程中起到重要作用。为了更好的研究该基因的功能，本实验选取了二穗短柄草，二倍体小麦2A和2D作为候选 的禾本科模式植物，希望建立用来替4-t4,麦来研究禾谷孢囊线虫和其寄主互作分子机制的模式系 统。通过禾谷孢囊线虫接种实验，活性氧ROS含量检测，qRT-PCR，植物根部组织组织学分析，大麦条斑花叶病毒诱导的基因沉默BSMVoVIGS在候选禾本科植物上的应用等技术检测了禾谷孢囊线虫与3种候选禾本科模式植物的亲和性，并对非亲和寄主分析可能原因，以及对亲和寄 主进行了接下来的沉默实验。研究结果表明禾谷孢囊线虫可以侵入到Bd213根部，但不能完 成其生活史，并发现这种非亲和性并不依赖于禾谷孢囊线虫种群差异。此外，我们在接种禾谷孢 囊线虫后3天的二穗短柄草根组织中观测到强烈的ROS迸发，并发现在这个时间点有7个第三 类氧化酶基因和2个NADPH氧化酶基因表达显著上调。随后，我们发现禾谷孢囊线虫可以在二 倍体小麦2AG1812矛a 2DAL878qbt常发育，完成生活史，且发育进程、各虫态所占比例与对照基本上一致。解剖学结果表明2D中的合胞体细胞稍小，2A中合胞体发育正常。在孢囊形成上，2A和对照的单株孢囊数相当，而2D的单株孢囊数稍低。在实验室中，在小麦上建立大麦条 斑花叶病毒诱导的基因沉默体系，成功将小麦靶标基因PDS沉默，出现光漂白现象，并确定了沉 默效果最好的小麦品种济麦22作为实验室今后VIGS相关实验寄主小麦。在二倍体小麦2A上建 立大麦条斑花叶病毒诱导的基因沉默体系仍然在构建中。本研究克隆了HaG20E03基因，并明确其在禾谷孢囊线虫食道腺细胞中特异性表达。本实 验还明确了二穗短柄草是禾谷孢囊线虫非寄主，无法作为与禾谷孢囊线虫互作的模式寄主，并认 为ROS迸发是其不亲和性重要原因之一，POX基因可能在其中起到关键作用。而二倍体小麦2A 和2D均与禾谷孢囊线虫亲和，2A对禾谷孢囊线虫更敏感，有更大的可能性作为研究禾谷孢囊线 虫和其寄主互作的模式寄主。本实验结果将为禾谷孢囊线虫与寄主互作分子机制奠定基础。关键词二穗短柄草，二倍体小麦2A和2D，活性氧ROS，病毒介导的基因沉默VIGS，禾本科模式植物，推定效应子万方数据AbstractCereal cyst nematodeCCNis one of the most important plant pathogens of wheat worldwide， posing a high threat on wheat productionPlant nematodes secret effector proteins towards host plant cells by their stylet，resulting in successful nematode parasitism and plant diseaseBut the researches of molecular interaction between CCN and its host seem to be very lacking and backward so far mainlybecause of a lack of an effective and applicable pathosystemIn this study,we cloned a putative CCN effector gene by RACE according to transcriptional data The full length for this gene cDNA is 837 bp，almong which owns a 585 bp ORF,encoding one1 94一aminoacids peptideIn Nend of this genethere is a 2 1一aminoacids signal peptideIn addition， we found no transmembrane domain within this geneBy BLAST,we found this gene had a high similarity with G20E03 gene in Heterodera glycinesTherefore we named this HaG20E03By in situhybirdationwe found the transcripts of HaG20E03 accumulated specifically in the gland cells of Havenaeindicating that HaG20E03 may play a vital role in Havenae parasitismIn order to better understand the function of this gene，cereal model plant Brachypodium distachyon，diploid wheat 2A and 2D were considered as the candidate cereal model plant for CCN to replace wheat to investigate the CCNhost interactionsIn this study,by CCN inoculation assay,ROS content measurement，qRTPCR，histological analysis of the syncytia and barley stripe mosaic virusinduced gene silencingBSMV-VIGS，we assayed the compatibility between CCN and these three cereal candidate plants，and assessed possible reason for this incompatibility and did silencing study in the compatible plantThis study indicated that CCN could infest into the roots of Bd2 1-3 but fail to develop into the following stages and complete the life cycle，and this incompatibility was not dependent on the CCN population differenceIn addition，we found there was a strong ROS burst at 3 days post inoculation，and at this time point，seven Class III peroxidase genes and two NADPH Oxidasegenes were significantly up-regulated after CCN inoculationWe then found CCN could both infest intothe roots of G 1 8 1 2 and AL878 and develop into J3，J4 and adult femaleMoreover,the developmental processes and percentage of each CCN stage in test plants were quite similar with those in susceptible wheatHistological analysis of the syncytia in diploid wheat induced by CCN showed the syncytia in 2D showed a little smallerThe number of cyst ed in 2A is fairly similar with that ed in contr01 By contrast，2D showed a somewhat resistance to CCNWe also established a system of BSMV-VIGS in our labWe successfully silenced the target gene PDS in wheat and the test wheat showed photobleaching effectsIn addition，we selected Jimai22 that has the best silencing effect as host wheat for V1GS assays in the futureFurthermore，the study of a system of BSMV-VIGS in diploid wheat 2A is still ongoingIn conclusion，in this study,we cloned HaG20E03 from hravenae，and revealed that the transcripts of HaG20E03 accumulated specifically in the gland cells of HavenaeAll of these could contribute to a beRer understanding of CCNhost interactionsWe also confirmed Bdistachyon is a万方数据nonhost for CCN and failed to be severed as a model plant for CCN-host interactionsMoreover,we found ROS burst may be an essential reason for this incompatibility and POX genes may play a key role for itBy contrast，both diploid wheat 2A and 2D Was compatible with CCN2A showed more susceptible to CCN，indicating that 2A have a strong potential to be a cereal model plant in research of CCNhost interactionsKey wordBrachypodium distachyon，diploid wheat 2A and 2D，reactive oxygen speciesROS，virus induced gene silencingVIGS，cereal model plant，putative effector万方数据目录第一章引言111植物寄生线虫112禾谷孢囊线虫及其危害1121孢囊线虫简介1122小麦禾谷孢囊线虫及其危害113推定效应子基因G20E03研究进展5131植物线虫效应子研究进展5132推定效应子基因G20E03研究进展514禾本科模式作物研究进展6141目前主要禾本科模式植物6142二倍体小麦2A和2D7143应用于植物线虫与寄主互作的模式平台815病毒诱导的基因沉默VIGS研究进展8151 VIGS技术的建立、发展与应用8152大麦条斑花叶病毒BSMV诱导的基因沉默916研究目的及意义10161目的10162研究意义10第二章禾谷孢囊线虫Heterodera avenae推定效应子基因G20E03的克隆与定位分析 1 121实验材料1l211供试禾谷孢囊线虫1122禾谷孢囊线虫G20E03基因的全长克隆和定位分析1l221禾谷孢囊线虫G20E03基因的全长克隆11222禾谷孢囊线虫G20E03基因的原位杂交1823结果与分析21231禾谷孢囊线虫G20E03基因cDNA全长克隆21IV万方数据232禾谷孢囊线虫G20E03基因序列分析23233禾谷孢囊线虫G20E03基因原位杂交2324讨论与小结24第三章禾谷孢囊线虫Heterodera avenae对不同禾本科寄主的侵染研究26 31实验材料26311供试禾谷孢囊线虫26312候选的禾本科寄主植物2632禾谷孢囊线虫对二穗短柄草和二倍体小麦的侵染实验26321温室接种方法2632。2染色方法27323根组织内线虫形态观察和数量统计27324植物根组织内ROS含量的测定27325 ROS产生相关基因的定量分析28326植物根组织中禾谷孢囊线虫诱导的合胞体组织学分析3033结果与分析30331禾谷孢囊线虫对二穗短柄草的侵染实验30332二穗短柄草根组织中ROS含量测量和ROS产生基因表达分析32333禾谷孢囊线虫对二倍体小麦2A和2D的侵染实验3524讨论与小结36第四章大麦条斑花叶病毒BSMV诱导二倍体小麦2A基因有效沉默体系的探索3841实验材料38411供试植物二倍体小麦2A38412 BSMV病毒载体38413本氏烟3842大麦条斑花叶病毒诱导基因沉默体系在二倍体小麦2A的探索38421本氏烟种植和培养38422 BSMV质粒的提取39423农杆菌感受态细胞的制备39V万方数据424农杆菌感受态细胞的转化39425 BSMV诱导的基因沉默其过程40426实时定量PCRRealTime PCR检测4243结果与分析42431适合大麦条斑花叶病毒诱导基因沉默体系的小麦品种筛选42432大麦条斑花叶病毒诱导基因沉默体系在二倍体小麦2A上的探索4444讨论与小结45第五章全文结论46参考文献48附录55致谢56作者简历57VI万方数据英文缩略表VII万方数据中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言第一章引言11植物寄生线虫线虫Nematode通常又被称为蠕虫Worm。线虫动物门是动物界较大的一个门之一，为 假体腔动物，迄今为止，已经有超过28000个物种被记录。线虫可以生活在海洋、淡水、土壤甚 至其他一些极端环境中刘维志，200l，Perry and Moens，2013。其中有一类线虫通过寄生植物， 从植物中吸取营养物质，来维持自己生存，这一类线虫被称为植物寄生线虫Plant Parasitic Nematode。植物寄生线虫危害植物健康，造成作物产量受到严重受损，同时破坏了作物品质， 其治理是全球农业生产上的一大难题，植物寄生线虫每年给全球农业生产造成大约750亿英镑的 损失Nicol etaL，2011。早在1743年，Needham博士从小麦粒中发现了小麦粒线虫Anguinatritici，这是人类第一次意识到植物寄生线虫对作物的危害Needham，1989。到目前为止，已经有4100 余种植物寄生线虫被报道。曾有一句谚语说的好凡是有植物的地方就有植物线虫。可见植物寄 生线虫给农业生产，给农户造成了多大的困扰。植物寄生线虫已经进化出多种策略来寄生植物寄 主，而其中最为复杂，也是目前研究得最多的寄生策略的就是植物内寄生线虫sedentaryendoparasitic nematodes的寄生模式Hewezi and Baum，2013。它们通过口针将自身食道腺细胞 所分泌的一类蛋白质分泌到寄主植物的根组织细胞中，从而改变寄主的基因表达并诱导植物寄主 根组织形成一种独特的取食位点，促进自身的寄生作用。这一类蛋白质被称作效应子effector Mitchum etal，2013。植物内寄生线虫中对农业生产危害最大也是目前研究较多的主要包括孢囊 线虫cyst nematode和根结线虫rootknot nematode。1。2禾谷孢囊线虫及其危害1。21孢囊线虫简介孢囊线虫是一类世界范围内广泛分布，并危害多种农作物的重要植物线虫，每年给农业生产 带来了严重的产量损失Jones et a1，2013。孢囊线虫主要分为两个属孢囊线虫属Heterodera 和球孢囊线虫属Globodera。在农业生产中，最具有经济重要性的孢囊线虫包括大豆孢囊线 虫Heterodera glycines，马铃薯孢囊线虫Globodera pallida and Grostochiensis以及禾谷孢囊线虫Heterodera avenae and 14filipjeviJones et a1，2013。此外，甜菜孢囊线虫Heteroderaschachtii其可侵染拟南芥，通常被作为模式种来研究作物孢囊线虫与寄主植物的分子互作Jones et a1，2013。孢囊线虫的孢囊可以对里面的卵块起到很好的保护作用。由于孢囊的抗逆性很强， 即使没有合适的寄主，孢囊也可以在土壤中存活好几年，甚至几十年，因此孢囊线虫病是一种及 其重要但又非常难以治理的土传病害，严重威胁着我国粮食安全彭德良等，2001。122小麦禾谷孢囊线虫及其危害1221禾谷孢囊线虫生活史小麦禾谷孢囊线虫H avenae在分类地位上属于线形动物门，侧尾线纲，垫刃目，异皮科，万方数据孢囊线虫属谢辉，2005；Perry and Moens，2013。禾谷孢囊线虫通常一年只发生一代，以孢囊 的形式在土壤或病残体中越冬和越夏。当土壤的温度、湿度条件适合时，孢囊内所含的卵将会孵 化为一龄幼虫。当一龄幼虫在卵内完成第一次蜕皮，钻出孢囊壳后，我们称之为二龄幼虫Juvenile 2。二龄幼虫可以在土壤中自由移动，当受到合适的寄主植物根组织的分泌物质吸引，二龄幼虫 会聚集到寄主植物根尖附近，刺破根表皮细胞，在靠近根尖生长点的位置侵染植物根组织刘维 志，2004。在根中的二龄幼虫经过短距离迁移，可以移动到中柱鞘附近，以薄壁细胞为侵入点， 诱导寄主植物形成取食结构一一合胞体Syncytium。禾谷孢囊线虫通过口针将大量效应子分泌 到合胞体细胞中，通过瓦解细胞壁，原生质体融合，大量临近的细胞合并等作用，最终线虫诱导 植物寄主形成了一个巨大的、具有多核的细胞。合胞体细胞代谢活跃，缺乏中央大液泡以及有着 浓厚的细胞质。线虫正是通过这个细胞从植物中吸取营养，合胞体的形成对于线虫的寄生作用是 不可缺少的de Almeida Engler et aL，2013。在随后的寄生过程中，禾谷孢囊线虫的体形不断膨大， 并经过两次蜕皮，分别发育到三龄和四龄幼虫阶段，此时禾谷孢囊线虫有了性别的分化，雌虫再 次蜕皮后形成一个椭球型，呈“8”行卷曲，而雄虫蜕皮之后又变成了线型，与雌虫完成交配后死 亡。交配后的雌虫在寄主植物根组织中不断膨大，最终突破寄主植物根表皮。开始附着于寄主根 表面，随后掉落到土壤中。此时，土壤中的雌虫为白色，经进一步发育后褪去结晶膜，最终显现 出褐色Jones，1981；Heinrich etal，1998。雌虫死亡后即为孢囊，可以作为下一季的侵染源Lilley甜aL2005。图11禾谷孢囊线虫的生活史LaSSc丌cetal1996Figure 11Lifc cycle of cecal cyst nematodeLasserre et a1，1 9961222禾谷孢囊线虫孵化特性禾谷孢囊线虫孵化受到温度的影响，通常需要一段时间的低温刺激。这种滞育的特性通常被 认为是与小麦协同进化所造成的。在自然条件下，通常华北地区的禾谷孢囊线虫孢囊要经过至少 35天以上，4-7。C的低温刺激才可孵化出二龄幼虫苏致衡等，2013；李秀花等，2013。经过低2万方数据中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言温刺激后，适当的提高温度可以诱导禾谷孢囊线虫二龄幼虫大量孵化。持续的16莉激一周左右， 会达到孵化高峰郑经武等，1997。受到低温刺激达30天以上时，孢囊保持持续的活力，并且 在80天，即使温度一直保持低温，也会出现持续孵化的现象，但是不会出现孵化高峰郑经武 等，1996。不同程度的低温刺激，并不会降低禾谷孢囊线虫的滞育时间。相反，过低的环境温 度反而降低孢囊孵化率，造成禾谷孢囊线虫死亡。122_2禾谷孢线虫分布与危謇特点禾谷孢囊线虫可以危害小麦，大麦，燕麦等多种禾谷类粮食作物。禾谷孢囊线虫自1874年 在德国被发现以来，目前世界上已有38个国家和地区发现该病原，遍布了亚、非、欧、美、澳 五大洲，并造成了不同程度的危害，但总体而言，全球因为禾谷孢囊线虫所造成的损失占由植物 寄生线虫所造成的损失的10Whitehead，1998，Nicol，2006。同时，禾谷孢囊线虫还可以与其 他多种植物病原，如一些细菌与病毒发生复合侵染，加剧了小麦种植区的产量损失Barker and Koenning，1998，Kumar,et a1，2014。CEREAL CYST NEMAToDECCN-二之二簟k蠡k摹“ 1_1气争乞图12禾谷孢囊线虫的世界分布Nicoi et a12008 Figurel2World distribution of cereal cyst nematodeNicoi et a1，2008在中国，禾谷孢囊线虫自1989年于湖北省天门县被发现以来Chen et a1，1989，至今己 在16省直辖市，300多个县市发生，包括北京，天津，湖北，河北，河南，山东，安徽，山西， 陕西，青海，宁夏，内蒙，新疆，西藏，甘肃，江苏苏致衡等，2013；彭德良等，2012；王明 组等，1997；王振跃等，1993；杨远永等，2010；郑经武等，1996；赵杰等，201l；候生英等， 2008；陈新等，2009；黄文坤等，2011；叶文兴等，2010李惠霞等，2012；李红梅等，2010， 发生面积6000多万亩，几乎涵盖了我国全部的小麦生产区，已经成为我国小麦安全生产的严重 现实问题。万方数据胖囊。一戆一n辔薹洳7Sr孓蔫I NiagxiaHuiAutonOnluG1甲l|d“参气咖nReglow,囊Dk2庠2 GUmngxiZhu“g