动物源性成分分子生物学检测技术研究进展_陈基耘.pdf

281 专题论述 食品工业 2023 年第44卷第 4 期 动物源性成分分子生物学检测技术研究进展 陈基耘 广东省珠海市质量计量监督检测所（珠海 519002） 摘要食品中肉源性成分的鉴定技术是目前打击肉制品掺假、保障肉制品质量安全的重要手段。近几年, 基于 分子生物学原理的动物源性成分鉴定技术层出不穷, 已逐渐成为该领域的主流技术。因此, 该综述以分子生物学相 关的鉴定技术为主, 介绍不同的检测方法, 分析各自的优势, 并对该新技术的应用前景做简要的阐述。 关键词 动物源性成分; 分子生物学检测; PCR技术 Advances in Molecular Biological Detection Techniques for Identification of Animal Derived Components CHEN Jiyun Guangdong Zhuhai Supervision Testing Institute of Quality and Metrology Zhuhai 519002 Abstract The identification technology of meat derived ingredients in food is an important mean to combat the adulteration of meat products and to ensure the quality and safety of meat products. In recent years, the identification technology of animal derived ingredients based on molecular biology principles has been improved, and has gradually become the mainstream technology in this field. Therefore, this review focuses on identification technologies related to molecular biology, introduces different detection s, analyzes their advantages, and briefly describes the application prospects of this new technology. Keywords animal derived ingredients; molecular biological detection; PCR technology 基金项目广东省市场监督管理局科技项目（2021CJ07） 近年来，食品安全问题日益突出，不法分子利用 廉价肉掺入高价肉中，从而获取巨额利润。在我国， 肉羊是畜牧业的重要支柱产业之一，消费需求旺盛。 然而，用鸡、鸭和猪肉掺入或者替代羊肉的事件屡见 不鲜。这些事件的出现严重干扰了我国畜肉产业，损 害了消费者的权益，制约了肉品质量的提升甚至产生 了宗教信仰相关的问题。随着不法商贩的造假手段 日益翻新，肉制品质量安全的复杂性也逐渐增加， 因此，传统的鉴别技术已经不能满足市场监管的需 求。准确、高效、快速的多种动物源性成分检测技 术的开发，不仅能使消费者的权益得到保障，也是监 管部门工作的技术支持。目前，国内外已经研究出多 种检测方法，常见的肉制品鉴别方法包括形态学、代 谢组学、光谱学和基因组学方法等。形态学主要依赖 光学显微镜技术和数据图像分析像结合进行鉴定；光 谱学尽管分析速度较快，但是通常需要对大量样品进 行建模，而且通用性不强；蛋白质组学鉴定技术包括 电泳、化学技术和免疫学方法等。由于蛋白质结构容 易受温度、微生物污染、抗原交叉、反应剪切力等多 种因素影响，对仪器、试剂和样品处理要求高，存在 复杂、昂贵、费时且缺乏特异性等问题，因此，蛋白 质鉴定技术的可靠性和稳定性较差，并不能很好地满 足掺假肉检测的需求。近年来，以核酸分子鉴定技术 为主的生物学鉴定方法由于其灵敏度高、特异性强和 准确度高等优点，已成为国际上肉类源性成分鉴别的 主流技术。核酸分子鉴定能够克服蛋白鉴定方法的不 足，具有基质干扰小、易于操作和保存、鉴定成本相 对较低等优点，适宜在检测机构实验室中应用与推 广。因此，基于上述技术优势，文章对肉与肉制品中 多种动物源性成分鉴定相关技术进行介绍并进行展 望，以期为监管机构、检测机构的肉与肉制品安全监 督提供技术参考。 1PCR技术 PCR技术又称为聚合酶链技术（PCR），目前， 国内外进行多种动物源性成分鉴定的常用PCR技术包 括多重PCR 1-3 、实时荧光定量PCR 4-6 、限制性片段长 度多态性PCR 7-9 等。这些技术主要是通过在常规PCR 技术基础上加入荧光染料或标记探针，根据荧光信号 的累积对反应过程进行实时监控，以实现对起始模板 的精确定量和定性分析。自2007年以来，我国也陆续 颁布了一系列以PCR技术为主的国家标准 10-13 ，以满 足动物源性成分鉴定的检测和监管需求。但是这些标 准大多只用于定性鉴定，未进行定量分析。 多重PCR技术，又称多重引物PCR或复合PCR， 它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时 扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应 试剂和操作过程与一般PCR相同。如Iwobi等 14 选择-食品工业 2023 年第44卷第 4 期 282 专题论述 肌动蛋白基因和肌肉生长抑制素基因为分析对象，设 计引物和Taqman探针，采用三重PCR用于定性和定量 检测混合肉中牛源性和猪源性成分。多重PCR技术因 其灵敏度高、检测效率高的特点，目前已被广泛应用 于多种动物源性成分的同时鉴定，但该技术因在同一 反应中投入了多对引物，易引起交叉反应。 荧光定量PCR技术，荧光试剂的使用包括荧光探 针或者荧光染料。因所使用荧光试剂的不同，可分为 特异类和非特异类两类。特异性检测方法是在PCR反 应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检 测产物。而非特异性检测方法是在PCR反应体系中， 加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链 后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别 步骤，特异性更高，但后者则简便易行。这些技术 亦被广泛应用于肉类掺假的鉴定，Kang等 15 采用Subr Green染料，在1000.01范围内对猪肉和牛肉混合 样品中猪肉的含量进行测定，用于检测牛肉加工制品 中是否有猪肉掺假。 限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR- RFLP）技术，是用特异设计的PCR引物扩增目标材料 时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少， 以至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进 行酶切处理，以检测其多态性。如Uddin等 16 建立了 牛、水牛、鸡、鸭、山羊、绵羊和猪的七重PCR-RFLP 检测方法，用于生鲜肉及加工肉制品中目标物种的鉴 别。然而，该技术使用内切酶，这无形中增加了研究 成本，限制了该技术的广泛应用。 数字PCR是近年来发展起来的一种核酸分子绝对 定量技术。20世纪末，Vogelstein等 17 提出数字PCR的 概念，通过将一个样本稀释并分成几百到几万份，分 配到不同的反应单元，每个单元包含最多一个拷贝 的DNA模板，在每个反应单元中分别对目标分子进行 PCR扩增，扩增后对各个反应单元的荧光信号进行统 计分析。如Ren等 18 采用微滴数字PCR定量测定绵羊 和山羊肉产品中鸡肉的含量，并在检验过程中将动物 源成分质量比例转换为拷贝数的比例，结果表现出良 好的重复性和稳定性。与传统的PCR、荧光定量PCR 相比，数字PCR在定量上不依赖扩增阈值（C t 值）， 表现出更高的准确度和灵敏度，但是该技术通常使用 芯片完成，检测成本偏高，试验对操作人员及设备环 境的要求较高，因此难以在基层检测机构中普及。 2环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术（LAMP）是Notomi等 19 早在 2000年建立的一种新型的等温扩增方法。与传统的聚 合酶链式反应（PCR）相比，LAMP技术可以在恒温 状态下完成反应而不需要在精密的控温设备中对目标 模板进行反复的热变性，通常在0.51 h内就可以实现 目标序列进行10 9 倍的连续快速扩增。伴随着DNA片 段混合物的生成，大量的白色焦磷酸镁沉淀生成，通 过用SYBR green对DNA片段产物进行荧光染色或者对 焦磷酸镁生成后溶液的浊度进行分析，即可用肉眼或 者仪器判断样本中是否含有目标链。基于上述LAMP 检测技术原理的特殊性，该技术摆脱了复杂的精密仪 器的限制，能满足现场检测及执法的需求，结果肉眼 可判别，因此被应用于肉类快速检测中。如Cai等 20 研 发了一种可在20 min内检测出肉制品中猪源成分的实 时环介导等温扩增的测定法，这也是首次应用LAMP 法检测商业产品中的猪源成分。Zahradnik等 21 采用 LAMP法检测加工食品中马肉含量，能从制备的香肠 中检测到0.1的马肉。 3DNA分子杂交技术 DNA分子杂交的基础是具有互补碱基序列的DNA 分子，可以通过碱基对之间形成氢键等形成稳定的 双链区。在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的 DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的 方法，将双链DNA分子分离成为单链，这个过程称为 变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交， 其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。如 果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成 双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种 生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够 被检出。这种技术很早就被应用于肉类检测中，如 Buntjer等 22 建立了牛、羊、马、鸡、猪等多种物种的 分子杂交检验方法，在混合肉中可以检测到最低1 的目标肉，并且对于热加工的样品依然具有很好的检 测效果。然而，该技术DNA杂交技术作为一种基础的 检测技术，也存在灵敏度低、耗时长等缺陷。 4DNA条形码技术 DNA条形码技术是利用生物体DNA中一段保守片 段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。DNA条形码 （DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的、 标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片 段。在发现一种未知物种或者物种的一部分时，研究 人员便描绘其组织的DNA条形码，而后与国际数据库 内的其他条形码进行比对。如果与其中一个相匹配， 研究人员便可确认这种物种的身份。现今大部分动 物采用COI基因作为条形码标准片段 23 。目前，基于 DNA条形码技术的研究主要集中在水产品鉴别领域， 如李新光等 24 利用DNA条形码技术对15种烤鱼片进 行鉴定，结果发现仅有一种烤鱼片与标识相符，存在 大量的造假行为；Cardeosa等 25 在广州的市场上采购 了200种鲨鱼鱼鳍，这些鱼鳍中只有0.5含有完整的 COI序列。 283 专题论述 食品工业 2023 年第44卷第 4 期 5展望 随着人民生活水平的提高，群众对生活品质特别 是食品安全的关注一直是近年来的热点。快速、准确 地检测肉类源性成分，是我们迫切需要解决的问题。 基于分子生物学原理的检测技术，因其低廉、高效、 灵敏的优势，已成为目前国内外相关领域检测的主流 技术。但是，目前的检测技术在精准定量方面，效果 仍不尽人意，难以解决有意掺假和无意掺假等执法监 管难题。为此，针对以上窘况，开展针对性的研究， 才能为科学执法提供更准确可靠的技术支持。 6结语 综上所述，以分子生物学为基础的检测技术种类 丰富，其灵敏度高、特异性强及操作简单的特点，自 问世以来倍受青睐，在检测领域拥有很高的应用价 值。但基于分子生物学的检测技术应用于肉类掺假检 测领域仍存在一些挑战。比如，荧光染料与DNA双链 的非特异性结合或者体系中存在与靶基因同源的序列 都可能会影响结果的准确性。随着分子生物学检测技 术的飞速发展，新型荧光标记物的设计及新型检测模 式的深入探索，在肉类掺假检测领域，快速准确、低 成本、高通量的检测技术将指日可待。 参考文献 1 BEHRENS M, UNTHAN M, BRINKMANN Y, et al. Identification of animal species in heated and complex meat products using species specific PCR reactionsJ. Fleischwirtschaft International Journal for Meat Production real-time PCR assay targeting the mitochondrial D-loop regionJ. Food Chemistry, 2016, 210 102-106. 6 MENDOZAROMERO L, VERKAAR E L, SAVELKOUL P H, et al. Real-time PCR detection of ruminant DNAJ. Journal of Food Protection, 2004, 673 550. 7 SUNY L, LIN C S, Establishment and Application of a fluorescent polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism PCR-RFLP for identifying porcine, caprine, and bovine meatsJ. Journal of Agricultural 学科导论; 食品科学与工程 The Research and Practice of “Rain Classroom” in the Teaching of Food Science and Engineering “Subject Introduction” LI Peng, SONG Ge, DING Chao, FANG Yong School of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/School of Modern Food Engineering and Nutrition and Health Industry Nanjing 210023 Abstract In order to stimulate the learning motivation of college students of food science and engineering major, the “rain classroom” into the teaching application of “Introduction to Disciplines” is introduced. Adopt the four-in-one teaching implementation path of “pre-course preparationin-class interactionafter-class feedbacksemester assessment”, explore and uate the specific practice of the online and offline hybrid teaching mode based on “rain classroom” in the course of “Introduction to Disciplines”. The results show that the use of “rain classroom” not only enhances the dynamic interaction between teachers and students, improves students interest in professional learning, but also provides guidance for cultivating high-quality compound talents with multiple abilities, and provides a useful reference for promoting the teaching re of food science courses. Keywords rain classroom; introduction to disciplines; food science and engineering “学科导论”课程是我国高等教育人才培养改革 工程中一项极具创新性的改革措施 1 。“学科导论” 课程的开展有益于帮助大一新生对学校、专业及未来 的大学生涯筑建信心；有益于帮助学生深入了解所学 专业；有利于指导学生找到适合自身的学习方法，增 加学习的主动性 2 。食品科学与工程专业（简称食工 专业）授课内容繁多，包括化学类、生物类、工程类 等，调剂转入食工专业的大一学生理工科基础往往比 较薄弱，但在传统课堂教学方式下，通过单一PPT方 式教学很难激发学生对专业学习兴趣，课堂上容易产 生低头族。同时学生和教师之间缺乏互动，教师无法 了解学生的学习困惑，不能及时调整课堂教学内容。 久而久之，更加剧了大一学生对从事本专业的不满， 对未来大学学习生活失去信心。 20 CAI S, KONG F, XU S. Detection of porcine-derived ingredients from adulterated meat based on real time loop- mediated isothermal amplificationJ. Molecular and Cellular Probes, 2020, 53 101609. 21 ZAHRADNIK C, MARTZY R, MACH R L, et al. Loop-mediated isothermal amplification LAMP for the detection of horse meat in meat and processed meat productsJ. Food Analytical s, 2015, 86 1576-1581. 22 BUNTJER J B, LENSTRA J A, HAAGSMA N. Rapid species identification in meat by using satellite DNA probesJ. Zeitschrift fr Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung, 1995, 2016 577. 23 HEBERT P D N, RATNASINGHAM S, WAARD J R D. Barcoding animal life Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related speciesJ. Proc Biol Sci, 2003, 270Suppl_1 S96. 24 李新光, 王璐, 赵峰, 等. DNA条形码技术在鱼肉及其制 品鉴别中的应用J. 食品科学, 201318 337-342. 25 CARDEOSA D, FIELDS A, ABERCROMBIE D, et al. A multiplex PCR mini-barcode assay to identify processed shark products in the global tradeJ. PLoS One, 2017, 1210 e0185368-e0185377.